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RNA的变性琼脂糖凝胶电泳实验原理、材料和操作步骤

一、实验目的
 
学习RNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术。
 
二、实验原理
 
RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,可以分离混合物中不同分子量的RNA分子,凡是无法确定分子量。只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。
 
判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带,且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。
 
三、材料、试剂及器具
 
1、 材料
 
总RNA提取物。
 
2、 试剂
 
(1)0.1%DEPC水:200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀,室温放置过夜,高压灭菌。
 
(2)10x电泳缓冲液。
 
吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0)
 
NaAc 0.1mol/L
 
乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L
 
(3)50mL变性琼脂糖凝胶(1%)
 
(4)10x电泳缓冲液 5 mL
 
琼脂糖 0.5 g
 
0.1%DEPC水 36.5 mL
 
加热溶解,稍冷却,加入8.5 mL 37%甲醛。
 
(5)上样缓冲液:50%甘油,1mmmol/LEDTA,0.4% 溴酚兰,0.4%二甲苯蓝。
 
(6)甲酰胺(去离子)。
 
3、器具
 
(1)电泳系统
 
(2)紫外透视仪
 
四、操作步骤
 
1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
 
2、 制胶:
 
称取0.5g琼脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中,加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。
 
3、 加样:
 
在一个洁净的小离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀,置60℃保温10min,冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。
 
4、 电泳:
 
打开电泳仪,稳压7.5V/cm电泳。
 
5、 电泳结束后通过紫外透视仪观察。
 
五、注意事项
 
本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制,用具也用DEPC水冲洗,并灭菌。
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