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RNA免疫沉淀常见问题解答

1.  miRNA是什么?具有什么作用?
答:microRNAs(miRNA)是一种内源性非编码小分子RNA,一般具有18到25个核苷酸,其序列在进化上高度保守,通过靶向特定mRNA来调节基因的表达。
miRNA是越来越受关注的转录后调控网络(post-transcriptional control)中重要的调控因子。首先,miRNA结合到核糖核蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)复合物中,形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),然后通过不完全的碱基互补靶向到目标mRNA的3’UTR区,再通过引导酶切影响了mRNA的稳定性,或直接阻碍翻译过程,从而介导特异mRNA靶标的转录后基因沉默。
 
2.  RIP技术是什么?
答:RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。
 
3.  RIP技术与ChIP技术有什么区别?
答:RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用,但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物,RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定,RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶,抗体需经RIP实验验证等等)。
 
4.  RIP试验基本原理
答:
(1)用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
(2)防止非特异性的RNA的结合。
(3)免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
(4)结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或 高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
 
5.  RIP试验需要注意什么?
答:
(1)防止RNA与蛋白非特异性结合。
(2)避免RNA蛋白质结合被破坏。
(3)避免外源RNase污染。
(4)抑制内源RNase的活性。
(5)选择适合做RIP的抗体。
(6)避免RNA结合蛋白的降解。
 
6.  为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白?
答:
(1)先进行IP或者WB,测试抗体可以与目标RBP结合。
(2)另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。
(3)尽可能选用密理博RIPAb+抗体。
(4)稀释抗体成浓度梯度,进行IP测试。
(5)4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。
(6)确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。
 
7.  提取RNA时,蛋白酶K消化不完全是什么原因?
答:当进行蛋白酶K消化时,确保水浴温度应设置在55℃左右,长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。
 
8.  提取RNA后,A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因?
答:
(1)需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。
(2)测试提纯后RNA中是否存在RNA酶,可能RNA发生了降解。
 

9.  做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定?有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数,想知道如果用蛋白浓度的话,大概在什么数量范围的蛋白总量对应50 ul BEADS?

答:50 ul beads对应的是一个reaction,而我们推荐一个reaction是100ul裂解上清(2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到),所以只需要在裂解前计数一下,并按括号中的比例加入裂解buffer,后续100 ul 裂解上清就是一个reaction的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋白浓度的方法进行配比。
 
10.  RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗?
答:理论上,可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本,再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase,以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。
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