具体步骤：

      

1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。

      

2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。

      

3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入1.5mlEP管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。

      

4. 4℃，14000g离心15min。

      

5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。

      

6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。

      

*为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。

      

7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。

      

*目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。

8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。

      

9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。

      

10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。

      

11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。

      

12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。

      

13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。

      

14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。

15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。

     

16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。

     

17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。

     

18. 将上样样品煮5min。

     

19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。

     

20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。

     

21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。

RIPA Buffer配置

基础成分

（1）Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分）

（2）NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分）

（3）NP-40（用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂，用于提取蛋白）

（4）去氧胆酸钠（用H2O配置成10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存）

*因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠。