实验原理：

MTT法是Mosmann 1983年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

实验材料： 细胞样本

试剂、试剂盒：PBS  DMSO  胰蛋白酶   甘氨酸缓冲液    二甲亚枫

仪器、耗材：加样器96孔培养板酶标仪培养板

实验步骤：

二、贴壁细胞

1.  收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 ul，铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.  5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100 ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。

3.  5% CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5.  终止培养，小心吸去孔内培养液。

6.  每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7.  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

三、悬浮细胞

（4）细胞悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 ul 1640）。

2.  置37℃，5% CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

4.  离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 

四、MTT的配制

MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

1.  PBS配方

（1）NaCl ：8 g。

（2）KCl 0.2：g。

（3）Na2HPO4 ：1.44 g。

（4）KH2PO4：0.24 g。

（5）调pH7.4。

（6）定容1 L。

五、细胞的接种（铺板）

细胞过了30代以后就不要用了，因为状态不好了；培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。

接种时最好按照预实验摸索出的密度接种， 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。

且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。

（本文转载丁香通）