Annexin V & 7 氨基放线菌素（7-amino-actinomycin D, 7-AAD）或碘化丙啶（Propidium iodide, PI）双染法检测细胞凋亡原理。

正常细胞（活细胞）具有完好的细胞膜，此时细胞膜的组分之一——磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，当细胞发生凋亡时，细胞膜的结构发生改变，这使得原本在细胞膜内侧的PS外翻到细胞膜的表面，这种现象在凋亡的早期就会出现，因此就可以用与PS具有高亲和力、标记了荧光素的膜连蛋白V（Annexin V）来检测早期凋亡的细胞。

由于晚期凋亡和一些坏死的细胞也可以与Annexin V结合，因此需要引入另一种指标来将早期凋亡的细胞与之区分，这种指标就是细胞膜的通透性。与正常细胞和早期凋亡细胞不同，晚期凋亡及坏死细胞的膜通透性会增加，因此，一些原本不能进入到正常细胞内的核酸染料（如7-AAD和PI）便有机会进入细胞内与DNA结合。

所以，通过Annexin V和7-AAD /PI双染的方法，就可以把早期凋亡的细胞与晚期凋亡加坏死的细胞区分开来。

Annexin V和7-AAD双标测凋亡流式染色实例

小鼠腹腔巨噬细胞（每样2-5×105个细胞）Annexin V和7-AAD双染实例（本实例中巨噬细胞凋亡是通过紫外线30分钟照射诱导的）

1. 标志物：

活细胞：Annexin V-7-AAD-；早期凋亡细胞：Annexin V+7-AAD-；晚期凋亡和坏死细胞：Annexin V+7-AAD+；某种特定坏死细胞：Annexin V-7-AAD+；

2. 流式细胞仪：BD FACSCalibur；

3. 流式抗体及用量：1×Binding Buffer（250ul/test，联科生物的5×Binding Buffer用ddH2O配制，货号：LK-AP101-100-BB）；Annexin V-APC（1ul/test，货号：BMS306APC，eBioscience）；7-AAD（5ul/test; 货号：559925，BD）；

4. 染色条件：本实例用胰酶将细胞消化下来进行染色，并没有染细胞的表面分子，如需标记表面分子，切记勿用胰酶，请在染Annexin V和7-AAD之前先按常规染法标记表面分子，洗去多余抗体后即可用1×Binding Buffer重悬细胞，加入Annexin V和7-AAD，室温避光孵育15分钟即可。由于此法中细胞未固定，因此需在染色后尽快检测；

5. 分析软件：Cell Quest；

6. 圈门策略及染色：FSC/SSC圈门策略请视不同细胞而定；

7. 常见问题小贴士：

A. 由于细胞凋亡因细胞种类、细胞所在体内环境、体外给予的刺激、染色过程中的操作不同而迥异，因此Annexin V和7-AAD双染检测凋亡，需要按照各自具体情况进行多次实验，以掌握自己实验条件下细胞凋亡的套路。

B. Annexin V染色的常见特性如上图所示，即使未凋亡的细胞（Annexin V-7-AAD-细胞），经过染色后在流式图上的位置也会右移，小白曾经和多位做过凋亡的伙伴们交流过，这种现象是Annexin V染色特有的，请大家不要奇怪。小白曾经试图通过洗去多余抗体来将活细胞群（Annexin V-7-AAD-细胞群）调整到我们通常认为的“阴性细胞”位置，但是从实例图中大家也能发现这种方法是行不通的。至于为什么洗去多余抗体不能解决“移位”问题，请恕小编才疏学浅，至今还不知道原因，只是建议大家不要采用洗多余抗体的方法来调整细胞在图上出现的位置，相信大家也发现了洗过之后，各群细胞比例已经发生改变了。

C. 由于平时实验中的细胞来之不易，久而久之便养成了节约的好习惯，所以本实例中采用的细胞数量较少，如果小伙伴们采用的细胞数量可以土豪到106级别，可采用300ul-500ul体系，加2ul-5ul Annexin V和10ul 7-AAD，具体染色条件请自行采取滴度实验。

D. 使用Annexin V和PI试剂盒的童鞋染色也可按照试剂盒说明来操作。

E. 此法的上机检测过程没有特别之处，与一般分子的上机检测类同，小伙伴们无需多虑。只是提醒一下使用PI的小伙伴们，PI的发射谱很宽，可以用第二或第三通道来检测，大家任选其一即可。另外，小伙伴们要特别注意在FSC/SSC圈门时，所选细胞范围会对结果造成较大影响，大家自己分析的时候就会发现这一点，所以小伙伴们在分析的时候要把所有分析对象都圈进FSC/SSC的门内，这样才能反映真实情况。

F. 本法的优点在于无需固定细胞、染色快速，但是缺点是当细胞膜破裂时Annexin V也可与细胞结合，而且在一些自噬受损的细胞中，PS外翻可能受阻，所以此时Annexin V就不再适合用于早期凋亡检测了。