非病毒载体介导的基因治疗有许多优点，但就目前大多数表达体系而言普遍存在外源基因表达水平低而短暂等问题为了使外源基因稳定持续表达，必须对质粒DNA 进行改造。附着体质粒载体(episomal vector)可以使外源基因以附着体形式复制，分离到子代细胞，从而使基因高效持续表达，是种新型的非病毒表达载体。

   我们构建了以EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)复制子(EBV replicon，EBVR)为基础的附着体质粒载体，并将报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein．EGFP)克隆至它的多克隆位点，观察其在COS-7细胞中的表达。

   试剂

   各种限制性内切酶；T DNA连接酶、无DNA酶的RNA酶和100 bp DNAMarker；Klenow酶；Lambda DNA HindIll Marker；Trizol试剂、Taq DNA聚合酶和琼脂糖；酵母抽提物、胰蛋白胨；DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA分离纯化试剂盒；Lipofectamine 2000阳离子脂质体、Opti-MEM、DMEM培养基和M-MLV逆转录酶；小牛血清；G418；DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I1。

   质粒

   pGL3-promoter；含EBVR的质粒p220.2。

   重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR的构建

   采用StuI和XbaI消化p220.2，获得长4.7 kb的EBVR，包括EBV核抗原1(EBNA1)和OriP，克隆至pGL3-promotor的SV40启动子下游Hind Ill(Klenow酶补平)和XbaI之间，构建重组质粒载体pGL3-EBVR。pGL3-EBVR经Bgl I1和BamH I双酶切得到SV40启动子和EBVR片段，插入pcDNA3-EGFP(图1A)中CMV启动子上游BglI1位点处，构建重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR。

   重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR的构建

   采用Hindin和EcoRI消化pCL，获得800 bp的人13-IFN基因上游IFN-MAR，将此片段克隆至pBluescript中，构建重组质粒载体pBlue-MAR。再将MAR片段经SalI和XbaI双酶切插入pGL3-EBVR的EBVR片段下游，构建pGL3-EBVR-MAR。经Hind Ill消化，Klenow酶补平，将5．3 kb的EBVR-MAR片段亚克隆入pcDNA3中CMV启动子上游Bgl I1与Ⅳ，MI位点之间，构建重组质粒载体pcDNA3-EBVR-MAR。将聚合酶链反应(PCR)扩增所得的EGFP片段插入pcDNA3-EBVR-MAR的Hind11I和XhoI之间，得到重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR-MAR。经MfeI和EcoRI消化去除OriP片段，T 连接酶连接，构建得到重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBNA1MAR。

   质粒纯化和鉴定

   所得质粒按质粒纯化试剂盒要求进行抽提纯化。测定光密度值(D260nm )，鉴定质粒的量和纯度，酶切，电泳鉴定。

   细胞转染

   细胞株COS-7在含10％ 小牛血清的DMEM培养液、5％CO 、37℃ 恒温箱中培养。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导质粒pcDNA3-EGFP.EBVR和pcDNA3.EGFP.EBNA1.MAR转染细胞COS.7。具体操作参照产品说明书。48 h后检测目的基因表达或以1：20传代后加入G418(400 g／mL)筛选，每2～3天换液1次。10～14 d后抗性克隆形成，分离并扩增各单克隆细胞。分别在转染后14、28、60 d检测目的基因表达。

   EGFP基因表达检测

   1．荧光显微镜观察EGFP基因表达：通过荧光显微镜观察荧光细胞数及荧光强度，并摄片。

   2．流式细胞仪检测EGFP基因表达：pcDNA3-EGFP.EBVR和pcDNA3.EGFP.EBNA1．MAR转染细胞48 h。14、28、56、90 d后0．25％ 胰酶消化，PBS洗涤，用含1％ 甲醛的PBS固定细胞后用流式细胞仪(Becton Dickinson FACS calibui)检测荧光细胞数及荧光强度。以未转染质粒DNA 的细胞作为空白对照。

   3．逆转录(RT)-PCR检测EGFP cDNA转录：细胞转染后14、28、60 d采用Trizol试剂抽提细胞总RNA。具体操作参照产品说明书。DNase I孵育去除残留的基因组DNA，紫外分光光度计定量后，以GAPDH基因片段作为内参照，RT．PCR检测EGFPmRNA转录。EGFP引物：上游：5’GCGAAGCTTCCATGGTGAGCAAGGGC 3’；下游：5’CCAGGATCCGCCGC 兀TACTTGTAC 3’；扩增片段长度为719 bp。GAPDH 弓I物上游：5’TGGGGAAGGTGAAGGTCGG3’；下游：5’CTGGAAGATGGTGATGGGA 3’；扩增片段长度为233 bp。PCR扩增条件：95℃ 5 min后，94 ℃ 1min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。

   细胞内Hirt’S小分子DNA抽提及分析

   按照Hirt’S方法 在转染后14、28、60 d抽提COS．7细胞内小分子DNA。具体方法：用10 mmol／L Tris．HC1(pH 7．5，1 mmoI／L EDTA，1％ SDS，200 g／mL Pro—teinase K)1 mL裂解5×10。个细胞，37℃ 保温2 h；裂解细胞液内加入5 mol／L NaC1 0．25 mL，轻轻混匀，4℃ 过夜；4℃ 离心，15 000×g 30 min；取上清，酚一氯仿抽提，乙醇沉淀，20 TE液(pH 8．0，10 mmol／L Tris—HC1，1 mmoI／L EDTA，25 g／mL无DNase的RNase)溶解。为了鉴定获得的Hirt’S小分子DNA的完整性，取出5 μL，电穿孑L法转化大肠杆菌JM109，还原质粒。观察所得细菌克隆数，并挑取转化克隆质粒小量制备。以原始质粒作为对照，适当限制性内切酶酶切，0．8％ 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

   Southern印迹分析

   取抽提所得小分子DNA10  μL，XhoI酶切，1％ 琼脂糖凝胶电泳。毛细管法将DNA转移到尼龙膜上。pcDNA3-EGFP 10 Ixg采用Hind11I和BamHI进行酶切，电泳，回收719 bp EGFP片断，取1 g按试剂盒说明用DIG-High Prime进行DNA探针标记。按DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter KitⅡ说明进行预杂交、杂交及化学发光检测。