红色荧光蛋白（red florescence protein，RFP）是细胞研究的常用蛋白标记，是细胞生物学示踪研究中的重要标记物，荧光显微镜下可被直接观察，因此被广泛用于肿瘤的生长、浸润及血管发生等追踪性研究［。质粒转染和病毒转染是将RFP 转染到细胞内的常用方法。慢病毒作为一种较新的病毒载体，具有转染能力强、毒性小、目的基因表达稳定等优点。

   通过含有红色荧光蛋白基因的慢病毒（Lentivirus）转染人脑胶质瘤干细胞，以探讨慢病毒载体介导RFP 基因转染标记人脑胶质瘤干细胞的转染有效性，为胶质瘤干细胞的实验研究和示踪，提供一种有效的病毒转染方法，为胶质瘤干细胞的研究提供基础。

   1 材料与方法

   1.1 实验材料和仪器

   人脑胶质瘤干细胞、红色荧光蛋白基因的慢病毒（RFP-Lentivirus）；CD133，Nestin 兔抗人，FITC、Cy3 免疫荧光试剂盒；DMEM/F-12，N2 添加剂，BFGF，EGF 因子；荧光显微镜，倒置显微镜；CO2 培养箱。

   1.2 方法

  （1）脑胶质瘤干细胞的培养与传代，鉴定

   将人脑胶质瘤干细胞SU2 反复吹打成单细胞悬液，接种于无血清干细胞培养基（含DMEM/F12，EGF 20ng/ml，bFGF 20ng/ml，1/100N2）培养瓶中，置于37℃，5%CO2 培养箱。每天观察细胞生长状态，于显微镜下观察、摄片，并连续培养传代。然后取生长良好的未转染RFP 的悬浮球体行CD133、Nestin 免疫荧光染色。

  （2）慢病毒转染胶质瘤干细胞

   将球状干细胞用0.02% 胰酶消化后反复吹打成单细胞悬液，稀释胶质瘤干细胞计数1000~100000 个转移至24 孔板，每孔设2~3 个复孔。每孔加400μl 培养基，待细胞生长良好、细胞密度达30%~40%，每孔加1~2μl 带红色荧光病毒颗粒，轻轻混匀，病毒量不宜过高。8h 左右离心后弃培养基，换上新鲜培养基。2~3d 后在荧光显微镜下观察红色荧光表达情况。

  （3）转染率

   检测 将生长良好的转染后的胶质瘤干细胞连续多次体外传代，用胰酶制成单细胞悬液，PBS 反复冲洗，在200 倍荧光显微镜［激发波长488nm、发射波长（530±15）nm］下进行RFP 阳性细胞计数。每个样本计数10 个视野，每个视野计数100 个细胞。计算RFP 阳性细胞的转染率。转染率=RFP 阳性细胞数/ 细胞总数×100％。

  （4）生长曲线绘制

   将球状SU2 和RFP-SU2 经0.02 ％胰酶消化并离心后加人DMEM/F12 培养液制成单细胞悬液并行细胞计数。将两组细胞分别分成9孔，每孔设置3 个副孔，细胞以5×103 ／孔接种于96 孔板，置于37℃、5％ CO2 条件下培养。分别于培养的24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d 进行检测，每孔加入5mg/ml MTT 溶液20μl，37℃、5％CO2 的条件下孵育4h 后终止培养。小心吸净上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μl，平板床振荡10min。在酶联免疫检测仪上测定细胞的吸光度（OD）值，所用实验波长为490nm。将RFPSU2组与未进行RFP 转染的单纯SU2 生长对照组于转染后每日按上述步骤进行MTT 检测。以时间为横轴，OD 值为纵轴, 绘制两组细胞的生长曲线。

  （5）慢病毒转染后脑胶质瘤干细胞的免疫荧光染色

   取经多次体外连续传代培养慢病毒转染后的脑胶质瘤干细胞（RFP-SU2）行CD133、Nestin 免疫荧光染色。具体步骤：将RFP-SU2 种植到经多聚赖氨酸处理的玻片上，56℃温箱中烘干，PBS 洗3 次，4% 多聚甲醛室温固定20min，PBS 洗2 次，0.1% Triton-X100 孵育10min，PBS 洗2 次；1%BSA封闭，室温孵育1h，PBS 洗2 次；分别加入适量以封闭液稀释的第一抗体CD133、Nestin，4℃孵育过夜；PBS 洗3 次，加入FITC（两种抗体只能加FITC，因为转染后的干细胞表达红色荧光蛋白）耦联的二抗，室温避光孵育2h ；PBS 洗3 次，以50%、70%、95% 和100% 四个浓度梯度的乙醇梯度脱水，甘油封片，取出盖玻片，覆盖在载玻片上，自然晾干，于荧光显微镜下观察，摄片。