一、免疫组化的作用

   组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

二、免疫组化原理

   应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，通过化学反应来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，有5%-10%的病例单靠常规染色难以作出明确的诊断，而借助免疫组化技术准确率可高达98%。

三、免疫组化的步骤

   1，切片，烤片60℃，1h；

   2，脱蜡及复水，二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；

   3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；

   4，微波修复，将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；

   5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；

   6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；

   7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；

   8，PBS洗涤3次，每次3min；

   9，滴加二抗，37℃，15-30min；

   10，PBS洗涤3次，每次3min；

   11，滴加SABC，37℃， 30min；

   12，PBS洗涤3次，每次5min；

   13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；

   14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；

   15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；

   16，苏木素复染2min，自来水冲洗；

   17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

   18，树胶封片，镜检。

四、免疫组化常见问题及分析

   1、 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象

   1）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；

   2）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

   2、边缘效应

   切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

   3、产生组织切片非特异性染色

   1）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

   2）DAB孵育时间过长或浓度过高；

   3）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

   4）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

   4、免疫组化染色呈阴性结果

   1）血清封闭时间过长；

   2）DAB孵育时间过短；

   3）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；

   4）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

   5、背景

   1）也要考虑血清封闭时间是否过短；

   2）适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。