目的:构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体,体外转导大鼠心肌细胞进行功能鉴定。
方法:合成大鼠Raf-1的靶序列和阴性对照序列,将退火后的DNA双链定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中,得到pAdTrack-siRaf-1质粒。 pAdEasy-1 骨架质粒是同源的。重组pAd-siRaf-1质粒,转染HEK293细胞,包装得到pAd-siRaf-1腺病毒颗粒,感染原代培养的心肌细胞。蛋白质印迹用于检测针对af 的 siRNA。 .-1、用于测量NF-κB基因抑制效率、3H-亮氨酸([3H]-leu)摄取率的液体闪烁计数器,用于测量细胞表面积的HJ2000图像分析系统。
结果:重组腺病毒载体被正确消化鉴定,制备的病毒感染效率高。携带af-1 的病毒颗粒可有效抑制af-1 表达、细胞表面积和 AngII 诱导的 [3H] 蛋白水平心肌细胞。 ] -Leu 增加和下调af-1 和F-κB 的表达。
结论:pAd-siRaf-1重组腺病毒载体构建成功,包装在HEK293细胞重组腺病毒中。转染心肌细胞后,可有效抑制Raf-1和NF-κB的表达,抑制心肌诱导。由于AngⅡ细胞肥大。