化学发光免疫分析放射免疫分析法有很高的灵敏度，但存在着放射性防护和同位素污染等问题。近年来，许多非放射性同位素标记的免疫分析方法相继出现。其中，在化学发光反应及抗原-抗体特异性识别基础上建立起来的一种新的非放射免疫分析技术--化学发光免疫分析法，由于这种方法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，仪器设备简单，试剂价格低廉，方法稳定、快速等优点，已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。
化学发光免疫分析包括三大类型：即标记化学发光物质的化学发光免疫分析；标记荧光物质的荧光化学发光免疫分析和标记酶的化学发光酶联免疫分析。下面以偶合放大化学发光酶联免疫分析法检测人血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)为例。

      (一)　原理

      尽管辣根过氧化物酶(HRP)可以催化Luminol-H２O２反应体系产生化学发光，但由于该体系的检测灵敏度不够高，不能满足酶联免疫测定的要求。因此，为了提高体系的检测灵敏度，可将HRP催化H２O２氧化曙红(Eosin)的反应与该反应产物增强HRP催化luminol-H２O２的化学发光反应相偶合，建立偶合放大化学发光酶联免疫分析法。这里，酶的活性是基于下列发光反应进行检测的:

      HRP
      luminol＋H２O２───→产物＋hν

      产　物

      ↑ 
Eosin＋H２O２ ──────┘HRP

      （二)　操作步骤

      1.　包被抗体　在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300μl用0.05M,PH9.6 碳酸盐缓冲液稀             释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4℃过夜。

      2.　洗涤　用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3次，每次加2ml，放置3～5min，用抽滤针头吸干管内液体。

      3.　加待检血清和阳性标准品　用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性标准品或待检血清,每管加入300μl。同时设阴性对照;空白对照管只加抗体稀释液。置37℃孵育2h。

      4.　洗涤　同2。

      5.　加酶标抗体　 用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg抗体，每管加入300μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37℃孵育2h。

      6.　洗涤　同2。

      7.　化学发光测定　给每管加入300μl底物溶液，置37℃保温20min。犎;后将小试放入LKB-1250 lumimeter中，并置于测量位置，加入300μl 5.0×10－４M luminol。记录仪记录化学发光强度。

      8.　同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。

      结果判定

      (1)　定性　按下列公式判别阴、阳性:



L样品－L空白　　　　 ┌≥2.1　为阳性
S／N ＝ ────────　＝　商│
L阴性对照－L空白　　　 └＜2.1　为阴性



      (2)　定量　以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线(标准曲线)，犜r待测样品中HBsAg的含量就可由测量的化学发光强度换算得到。

      (三)　试剂和器材

      1.　试剂

      (1)　缓冲液　a.　0.05M, PH9.6 Na２CO３-NaHCO３缓冲液(包被液)

b. 0.01M, PH7.4 PBS-Tween20缓冲液(抗体稀释液)

c. 0.02M, PH7.4 Tris-HCl-Tween20缓冲液(洗涤液)

      (2)　抗体　　a. 抗HBsAg抗体

b. HRP标记的抗HBsAg抗体

      (3)　抗原　　a. 正常人血清(HBsAg阴性对照)

      b. HBsAg阳性标准品

      c. 待检血清
      
      (4)　小牛血清

      (5)　底物溶液

1.0ml EDTA (1.0×10－２M）

2.0ml Eosin(1.0×10－３M）

1.0ml H２O２(7.5×10－３M) 　　用三蒸水稀释到25ml

0.4ml HCl (1.0×10－２M)

0.2ml Tween20 (1％)

      (6)　luminol 5.0×10－４M

      2.　器材

      (1)　LKB-1250 lumimeter

      (2) 隔水式电热恒温培养箱

      (3)　各种规格加样器，小玻璃试管，聚苯乙烯珠

      (4)　洗瓶、抽滤装置等
      (四)　注意事项

      1.　洗涤要彻底，以免因血清中其他来源的过氧化物酶类物质所产生的非特异性反
应，而影响测定结果。

      2.　实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。

      3.　为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清加以抑制。

      4.　当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，犎;后很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入luminol。

      5.　底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15min达到平衡时，牷/学发光强度则不再随时间的延长而变化，且在1h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15min后加luminol进行化学发光测定。

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