董太师门下的弟子最近耗费大量元神得了一批老鼠，又跑去他族求得一批圣物——人类标本，本以为离飞升上仙仅一步之遥，却在忙活了数天、耗费了三魂三魄，在 DAB 显色液滴在载玻片上的 N 刹那后，听到了自四海八荒传来的轰轰天雷——切片上的腊肉竟然毫无反应！

     弟子此次的天劫惊到了正在闭关的董太师，他放下正在研读的他山典籍《CNS》，走出山洞，细细端详了一番，缓缓说道：「你只学到了这门功夫的『形』，但『神』还缺些火候，现下，为师将把组化大法中需要提升的四个细节一一滴渡给你：

免疫组化正确姿势中的四个细节

     1. 标本固定——不仅仅是「切一切」和「泡一泡」

     温柔地取材：大刀阔斧取材的同时，视组织如珍宝，莫挤压组织，轻柔取材和镊取。尽量避开坏死区域。太大太厚的组织不利于均匀一致的固定，实质组织取材厚度应小于 5 mm。

     新鲜的固定液： 固定液 10% 中性缓冲福尔马林 (NBF) 需新鲜配置，商用型固定液注意其标注的有效期，避免使用过期变质的固定液。

     充分及时地固定：固定液要充足，其与组织的体积比最好大于等于 20 倍；取材后即刻固定。固定时需将瓶口封住，避免甲醛挥发。组织的固定时间不宜过长，一般过夜（12～24 h）即可。

     2. 修复大法——不仅仅是「煮一煮」

     微波炉修复：简单易行效果好，CST 推荐使用微波炉完成修复。

     合适的修复液：根据抗体说明书使用合适的修复液。用柠檬酸修复后，切片需浸泡在修复液中，自然冷却；而用 EDTA 修复后，切片可直接从修复缸中取出，直接进行下一步。

     注：使用不同的修复方式和不同生产商的抗体检测人肺癌组织中 EGFR 的表达。第一排为 CST 的 EGF Receptor (D38B1) XP^® Rabbit mAb（#4267），EDTA 的修复方式明显优于柠檬酸盐及胃蛋白酶，故在该抗体说明书中，标注了使用 EDTA 修复进行免疫组化实验。

     3. 对的抗体，对的使用——不仅仅是「买买买和加加加」种属和应用范围：确定该抗体可检测所需种属（Reactivity）的石蜡切片上完成组化实验（Application： IHC-P）。

稀释液和稀释比：查看抗体说明书，使用正确的一抗稀释液和稀释比。

     注：与#4060 在 TBST/5% NGS 中稀释后所得的信号强度相比，经 SignalStain^® 抗体稀释液稀释后的信号强度更强；而对于#4407，选择 TBST/5% NGS 作为抗体稀释液的效果更好。

     4. 匹配的二抗和显色系统——「配一配和滴一滴」

使用多聚 HRP（Poly-HRP）的二抗，即在二抗上连接大量 HRP，以充分放大信号；同时，配合优质的色原产品，提升灵敏度，增强信号。

     注：在人肺癌标本中使用 Sox2(D6D9) XP^® RabbitmAb#3579 检测 Sox2 的表达，使用基于多聚-HRP 的 SignalStain^® BoostIHCDetectionReagent 的检测灵敏度更高。

     注：DAB 色原比较：在人乳腺癌组织中使用 p-Stat3(Tyr705)(D3A7)XP^® Rabbit mAb#9145 检测 p-Stat3 的表达，使用不同的产品进行显色。与竞争者的 DAB 产生的信号相比，SignalStain^® DABSubstrateKit 的显色强度更佳。

CST 对实验细节进行了步步优化，抗体说明书也是为实验成功保驾护航的必备指南：

     注：使用 PLK1(208 G4)Rabbit mAb #4513 检测人结肠肿瘤中 PLK1 的表达，在经过辅助试剂的步步优化后发现，使用一抗稀释液#8112 稀释抗体，聚合物型二抗#8114 进行检测，DAB 显色试剂#8059 后，可以检出 PLK1 的阳性表达。

编后记

     免疫组化的实验步骤虽然较为简单，但是贵在精通，重在认真，要在细节，不忘 Protocol，方得 Result。（本文转载网络）